Йод проявляет структуру мембранных белков

Лабораторная работа 1.1. Анализ белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE)

В основе метода электрофореза лежит явление миграции заряженных частиц под действием электрического поля. Многие биологические микро- и макромолекулы, такие как пептиды, белки, нуклеиновые кислоты, обладают ионизируемыми группами и при определенном значении рН окружающей среды существуют в растворе в виде положительно заряженных частиц – катионов, либо в виде отрицательно заряженных частиц – анионов. Следовательно, под влиянием внешнего приложенного электрического поля эти заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду, в зависимости от своего результирующего заряда и молекулярной массы.

Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами идеального носителя. Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофоретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные молекулы, размеры которых соизмеримы с диаметром пор геля, движутся медленнее, а мелкие молекулы свободно и быстро проходят через поры геля. ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида, создающего линейную основу, и N,N′-метиленбисакриламида (BIS), служащего для поперечных «сшивок» линейных цепей.

В случае, когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Такая система была разработана в 1970 году Лэммли ( англ. Laemmli) для изучения процесса сборки капсида четного бактериофага Т4. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН, SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходило восстановление дисульфидных связей, что предотвращало выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфат-иона, имеющего в растворе отрицательный заряд.

Для окрашивания белковых зон на ПААГ-электрофореграмме используют несколько универсальных методов. Для этого разделившиеся зоны белков фиксируют раствором уксусной кислоты (1 – 10%), смесью уксусной кислоты и этанола (реже – метанола), раствором ТХУ, насыщенным раствором сульфата аммония и окрашивают, используя раствор красителя. Фиксация предотвращает размывание зон из-за диффузии белковых молекул в геле. Используют такие красители, как амидочерный (амидошварц), кумасси ярко-синий (марок G250, R250), Zn/имидазол, нитрат серебра. Окраска полос происходит пропорционально количеству белка в зоне. Окраска и количество полос, соответствующих белкам, также зависят от чувствительности того или иного красителя. Так, нитрат серебра выявляет зоны с меньшим содержанием белка, чем кумасси.

Рисунок 1 — Результаты электрофореза 7 образцов белков в полиакриламидном геле (ПААГ). После разделения белков, гель погружался в раствор красителя – Coomasie R250, который связывается с молекулами белков. Изображение (электрофореграмма) было получено сканированием окрашенного геля.

Электрофорез проводят в однородном электрическом поле, то есть в поле, напряженность E которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирующего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддерживающую среду – носитель (например, бумагу или гель). Сопротивление R буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u) данной молекулы называют скорость движения заряженной молекулы (выражаемой в см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Именно различия в электрофоретической подвижности белков, содержащихся в анализируемой смеси, делают возможным разделить эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).

1. Теоретические предпосылки

Ученые из международного коллектива с участием МФТИ показали, что давно известный метод «йодного фазирования» в структурной биологии оказывается неожиданно универсальным, если нужно определить структуру белка, живущего в клеточной мембране. Структура таких белков позволяет на молекулярном уровне понимать зрение, обоняние, работу нервной и сердечно-сосудистой систем.

При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания градиента рН обычно используют раствор полиамино-поликарбоновых кислот, которыми насыщают носитель. В отсутствии электрического поля эта смесь обычно имеет значение рН равное 6.5. При наложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3 до 10.

Исследователи показали, что метод гарантированно сработает в случае взаимодействия мембранных белков и ионов йода в растворе. Это связано с характерной особенностью всех мембранных белков в природе. Они устроены так, что на границе «мембрана-раствор» все белки несут положительный заряд, который компенсирует отрицательно заряженную поверхность мембраны. Йод сильно взаимодействует с этими зарядами и «садится» на белок в совершенно определенных местах, гарантируя успех экспериментального поиска фаз.

Скорость V движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения в окружающей среде. Сила трения прямо пропорциональна скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения белковой молекулы, обозначенный как f, зависит как от размера, формы и степени гидратированности этой молекулы, так и от свойств самой среды. Электрофоретическая подвижность белка зависит:

Рассматривая историю появления метода электрофореза, можно отметить, что впервые электрофорез был применен без какого-либо носителя: электрическая цепь между электродами замыкалась через буферный раствор, в котором и происходило разделение белков. Позднее при электрофорезе начали применять носители жидкой фазы – полимеры, служащие “каркасом” для буферного раствора. Применение носителей позволило заметно снизить конвекцию (перемешивание) и, следовательно, повысить качество разделения белков. Носитель может быть в форме порошка, пленки, геля и др. Последующие разработки были посвящены усовершенствованию свойств носителей.

В результате сополимеризации образуется трехмерная сетка геля. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу (рис. 3), что обеспечивает гидрофильность полимера. В то же время ПААГ не содержит ионизируемых групп. Для сополимеризации нужны инициаторы и катализаторы (окислительно-восстановительные системы – источники свободных радикалов). Чаще всего используют систему из двух компонентов: